青海省唐古特铁线莲质量控制标准的研究 --元素科学-元素平衡养生（疗）法

青海省唐古特铁线莲质量控制标准的研究

青海省唐古特铁线莲质量控制标准的研究

（1.青海师范大学思想政治理论课教学科研部，青海西宁810008；2．青海师范大学生命与地理科学学院，青海西宁810008；3．青海师范大学青藏高原环境与资源教育部重点实验室，青海西宁 810008）
摘要：目的对青海省唐古特铁线莲质量控制标准进行研究。方法采用薄层色谱法对唐古特铁线莲进行定性鉴定，展开剂为氯仿与丙酮(95：5)，显色剂为lO%硫酸甲醇；采用HPLC(LC -20IOHT)法测定唐古特铁线莲中齐墩果酸的含量，色谱柱为Phenomenex Luna C18( 250 mm×4.6mm，5ym)，流动相为矿（乙腈）+矿（0.20-/0磷酸水溶液）=35 +65，流量为1 mL/min，柱温为室温(25℃)，检测波长为205 nm。结杲薄层色谱鉴定中，供试品色谱与对照品色谱相应的位置上，显示出相同颜色的荧光斑点；齐墩果酸在0. 023 3 -0. 700 0 mg/mL范围内呈良好的线性关系，线性回归方程为y：2×106 x+360 803．r2 =0. 991 7，RSD为1.61%，并对青海省野生和栽培唐古特铁线莲中齐墩果酸进行了定量分析，结果显示前者平均值为0. 118 40-/0、RSD为2.511 3%，后者平均值为0. 065 10-10、RSD为2.92%。结论该法操作简单、快速、准确、灵敏、重现性好，可有效控制青海省唐古特铁线莲的质量。

Studies on Quality Standard of Clematis tangutica in Qinghai Province
LIU Yupingl, SU Xu2.3 , LA Ben2.3 , WU Xueming2
(l. Department of Ideological and Political Theory Teaching and Research, Qinghai Normal University Xining 810008, China; 2. School of Geography and Life Science, Qinghai Normal University, Xining 810008, China; 3. Key Laboratory of Education Ministry on Environments and Resources in Tibetan Plateau, Qinghai Normal University , Xining 810008 , China)

Abstract: Objective To study the quality standard of Clematis tangutica in Qinghai Province. Method
TLC was used to qualitatively identify the main ingredients using chloroform and acetone (95: 5) as a
development agent and l% sulfuric acid methanol as a chromogenic agent. HPLC ( LC - 20IOHT) was
used to qualitatively determine the oleanolicacid contents in Clematis tangutica adopting Phenomenex

Luna C18 (250 mm x4. 6 mm, 5 htm) column as chromatographic column and acetonitrile +0. 20-/oH3P04 water (35 +65) as the mobile phase at a flow rate of I mL/min. The column temperature was 25cC and the detection wavelength was 205 nm. Result On the same plate of TLC, the reference andcontrol medicinal material were on the same position corresponding to paflicular color in the spectrum.Linear rang of concentration was between 0. 023 3 -0. 700 0 mg and the specification curve equation: y=2 x 10 -6 X +360 803 . r2 = 0. 991 7, The returns - ratio is l. 61% . Meanwhile, the oleanolicacid ofwild and cultural Clematis tangutica from Qinghai province was quantitatively analyzed. The result
showed that the content on oleanolicacid of wild samples was 0. 118 4% and the value of RSD was 2. 51130-/o , and cultural sample was 0. 065 10-10 and the value of RSD was 2. 920-/o . Conclusion This method issimple, rapid, accurate, sensitive and the good reproduction quality. It can be used for the qualitycontrol of Clematis tangutica.Key words: Qinghai province; Ctematis tangutica ( Maxim. ) Korsh; thin layer chromatography;
HPLC; oleanolicacid
    店古特铁线莲( Clematis tangutica( Maxim.)Korsh)剐名甘青铁线莲、叶芒茶保（藏名），为毛莨科( Ranunculaceae)铁线莲属（ClematisL．）多年生草本植物，分布于青海、甘肃、新疆、陕西、西藏及四川西部n1。全草人药，可治风湿性关节炎，同时能健胃、消食、治消化不良、恶心，并有排脓、除疮、消痞块等作用。
    国内外有关铁线莲属植物药理和化学性质的研究已有较多报道，且许多生物学者已从该属植物中分离出多种不同类型的化合物，包括皂甙、黄酮类化合物、木质素、生物碱、挥发油等m 3。现代药理研究表明，铁线莲属植物的皂甙类化合物具有抗肿瘤、抗炎、镇痛等药理活性；黄酮类化合物具有降血脂和胆固醇的作用[14]，同时还可以消除自由基、抗肿瘤、保肝、泻下、保护心血管系统和抗病毒以及杀虫等光谱的生理活性，而且国内一些学者对青藏高原地区唐古特铁线莲中的黄酮类化合物、总皂甙和齐墩果酸含量也做了一定的研究报道。然而，迄今未见对该药材质量控制标准的研究探索，据此本文首次采用薄层色谱鉴定作为定性标准、齐墩果酸的含量测定作为定量标准并利用高效液相色谱测定萁含量，旨在为青藏高原地区药用植物中有效成分的合理开发利用及质量控制提供一定的理论依据。
1材料与方法
1.1材料
    唐古特铁线莲样品采于青海省西宁市西郊公园，经青海师范大学生命与地理科学学院吴学明教授鉴定为毛茛科、铁线莲属植物唐古特铁线莲(Clematis tangutica( Maxim.)Korsh)。取其地上部分干燥，粉碎，过20目筛，作为供试药材1；采栽培唐古特铁线莲地上部分，阴干、粉碎，作为供试药材2。
1.2试剂
    齐墩果酸对照品（批号110831 - 200802），购自中国药品生物制品检验所；所有有机溶剂均为分析纯；乙腈为色谱纯；水为屈臣氏纯净水，并经0. 45 ym水系滤膜过滤，自制0.2%磷酸水溶液。

1.3仪器
    Waters高效液相色谱仪（Waters 2695泵+Waters 1996检测器+EmPower色谱工作站）；色谱柱Phenomenex Luna C18 (250 mm x4.6 mm，5LJum)；KQ 3200 DE型医用数控超声波清洗器，由昆山市超声仪器有限公司生产；DK - S26型电热恒温水浴锅，由上海精宏试验设备有限公司生产；6202小型高速粉碎机，由北京环亚天元机械技术有限公司生产；RE - 52CS型旋转蒸发仪，由上海亚荣生化仪器厂生产；SHB -Ⅳ双B型循环水式多用真空泵，由郑州长城科工贸有限公司生产；TC - 15恒温电热套2 000 mL，由上海宁市华星仪器厂生产；DHG - 9053A型电热恒温鼓风干燥箱，由上海一恒科学仪器有限公司生产；Zf 20D型暗箱式紫外分析仪，由上海顾村电光仪器厂生产。
1.4薄层色谱鉴定
    分别取55 9供试药材1、2，加500 mL石油醚冷浸脱脂24 h，过滤，加入1 mol/L盐酸400mL，水浴加热回流水解4h，放冷后加入400 mL氯仿继续回流1 h，在分液漏斗中分离氯仿层，残液用氯仿萃敢2次，合并氯仿层，回收氯仿至8 mL，作为供试品1、2。在同一硅胶G薄层板上，以y（氯仿）+y（丙酮）= 95 +5为展开剂展开，取出，晾干，喷以10%硫酸甲醇溶液，115
cC烘干，显色15 min，置于荧光下观察，以齐墩果酸作为对照品。
1.5定量分析
1.5.1色谱条件流动相为y（乙腈）+y（0. 20-/0磷酸水溶液）=35 +65;流量1 mL/min;检测波长205 nm。
1.5.2对照品溶液的制备精密称取干燥至恒质量的齐墩果酸0. 140 0 mg，加甲醇溶解并定容至10 mL，作为对照品溶液。
1.5.3供试品溶液的制备野生唐古特铁线莲供试品溶液（供试品溶液1）的制备：取15 9野生唐古特铁线莲药粉，加100 mL石油醚冷浸脱脂24 h，过滤，加入l mol/L盐酸40 mL，水浴加热回流水解4h，放冷后加入40 mL氯仿继续回流1 h，在分液漏斗中分离氯仿层，残液用氯仿萃取2次，合并氯仿层，回收至干，加甲醇溶解，过滤，甲醇溶液定容至5 mL容量瓶中，即得供试
品1。
栽培唐古特铁线莲供试品溶液（供试品溶液2）的制备：取15 9栽培唐古特铁线莲药粉按上述方法制备，即得供试品2。
1.5。4方法学考察
    (1)线性关系考察：分别糟密吸取对照品溶液0.2、0.4、0.6、0.8、1.0和1.2 mL进样测定，以齐墩果酸的峰面积积分值(A)为纵坐标，齐墩果酸对照品的质量浓度(mg/mL)为横坐标，绘制标准曲线，得到回归方程。
(2)精密度试验：取0.014 mg/mL的齐墩果酸对照品溶液，按上述色谱条件进样10 l_cL，共5次，测定峰面积，计算出峰面积的相对标准偏差。
(3)重现性试验：取野生唐古特铁线莲（供试品溶液1）进行平行试验，按上述色谱条件测定其含量，然后计算各齐墩果酸峰面积相对标准偏差( RSD)，观察结果。
(4)稳定性试验：在室温条件下，精密吸取供试品溶液1在1、3、6、9和12 h进样测定。
(5)加样回收率试验：精密称取供试溶液1，5份，准确加入齐墩果酸对照品适量，依法测定，计算回收率。
1.5.5测定方法取对照品溶液，供试品溶液1、2各10 yL，注入高效液相色谱仪，记录65min的色谱图。
2结果与讨论
2.1 薄层色谱鉴定结果
    薄层色谱（图l-图2）显示，供试品色谱中，与对照品色谱上具有相同的Rf值，显出相同颜色的斑点；斑点自然光下显紫色，在荧光下显灰色，说明唐古特铁线莲地上部分含有齐敦果酸化合物。此外，在试验中还发现最初阶段采用的多种提取方法，如石油醚、甲醇、氯仿、乙醇回流等，粗制样品溶液经薄层检识均没有发现与齐敦果酸R，值一致的斑点，当再次取20 9用盐酸氯仿精制，依然没有看到对照斑点，然而最后将55 9药粉用盐酸氯仿精制至8 mL，结果看出了斑点。因此，本研究认为唐古特铁线莲中齐墩果酸是多以苷的形式存在的。
2.2   HPLC方法学考察结果
2.2.1线性关系考察由齐墩果酸线性关系考察结果可知，其线性回归方程为y=2 xl0-6 x+360 803，r2=0. 991 7，表明齐墩果酸在0.023 3-0. 700 0 mg．L-I范围内呈良好的线性关系(图3)。
2.2.2精密度试验本研究精密度实验结果如表l所示。由表1可知，齐墩果酸峰面积的RSD为0. 603 7%，表明仪器的精密度良好。

2.2.3重现性试验由表1可知，弃墩果酸含量的RSD为0.800-/0，表明重现性良好，实验数据可靠。
2.2.4稳定性试验由表2计算得知，齐墩果酸含量的RSD为0.463%，说明样品溶液在12 h内稳定。
2.2.5加样回收率试验由表3可知，齐墩果酸的平均回收率为98. 71%，RSD为1.61%。
2.3样品含量测定结果取供试溶液，分别进样10 VL，测定野生与栽培唐古特铁线莲中齐墩果酸的含量(n：3)，结果如表4所示。
从表4可见，唐古特铁线莲中齐墩果酸的含量较低，干粉野生唐古特铁线莲中齐墩果酸平均值为0. 118 4%、RSD为2.511 30-/0，栽培唐古特铁线莲中平均值为0.065 1%、RSD为2.92c-/o。产生上述含量的不同可能是由于野生和栽培条件的差异所致，这是由于在栽培驯化过程中，药用植物唐古特铁线莲需要有一个长期适应新外界环境条件的过程。

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有协同作用的元素
Cu} Fe. Mn. Mo. F. As. Co. I\ V. Si. S
Fe≠ Co. Cu. Cr. Ni. Mn. P. Zn. Mo. V
Mo≠ Ca. Mg. Cu. Zn. S. P. Fe. I
Ca≠ Sr. Zn. Mn. Fe. F. Mg. Si
Zn≠ Na. P. Ca. Fe. Co\ Mo. Se
Mn≠ Fe. Co. Cu\ Na. Ca. Mg
F≠ Fe. Al. Ca. Mg. Cu. B
V≠ Li. Zn. Mg. Mn. Co. Cu
I≠ CI. Se. Co. Mo. Cu
P≠ Zn. Mo. K. Fe. Ca
Co≠ Cu. Zn\ Fe. I. Mn
As≠ Mn. Fe. Co. Cu
Mg≠ Zn. Mn. Na. Ca
s Cu. Se. Mo
Se≠ I. S. Mo
Mn≠ Pb. Zn
Si i± Cu\ Ce
Sr i圭 Ca
Cr≠ Fe
V≠ Fe
Ce i± Si
引自《元素医学防病治病实用手册》